NY_T 2417-2013 副猪嗜血杆菌PCR检测方法（2014-1-1实施）
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ID： |
4E87E0E8022D413E81ED6BB400214D43 |
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文件大小(MB)： |
0.43 |
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8 |
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日期： |
2024-8-11 |
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ICS 11.220,B41 NY,中华人民共和国农业行业标准,NY/T 2417—2013,副猪嗜血杆菌PCR检测方法,Polymerase chain reaction (PCR) for detection of,Haemophilus parasuis,2013-09-10 发布2014-01-01 实施,中华人民共和国农业部发布,NY/T 2417-2013,刖 百,本标准按照GB/T 1.1—2009给出的规则起草,本标准由中华人民共和国农业部提出,本标准由全国动物防疫标准化技术委员会(SAC/TC 181)归ロ,本标准起草单位:中国农业科学院兰州兽医研究所,本标准主要起草人:逮忠新、贺英、储岳峰、赵萍、高鹏程,I,NY/T 2417—2013,副猪嗜血杆菌PCR检测方法,1范围,本标准规定了检测副猪嗜血杆菌（Haemo力/1，部s parasuis , HPS）的聚合酶链式反应（Polymerase,chain reaction,PCR）技术,本标准适用于副猪嗜血杆菌病的病原学检测,2材料准备,2. 1器材,PCR扩增仪、1. 5 mL离心管、2. 0 mL离心管、。.2 mL PCR反应管、水浴箱、台式高速温控离心机、,电泳仪、移液器、移液器吸管、紫外凝胶成像仪、冰箱,2.2 试剂,NET缓冲液（配制方法参见A. 1）、TAE电泳缓冲液（配制方法参见A. 2）,RNase A酶、蛋白酶K、,Taq DNA聚合酶（5 U/ル）、10 X PCR缓冲液（含Mgク丁）、脱氧三磷酸核昔酸混合液（dNTPs,各,2. 5 mmol/*L）、125 bpDNA分子质量标准、无水乙醇、酚ー氯仿ー异戊醇（25 ： 24 ： 1）、三羟甲基氨基,甲烷（Tris碱）、琼脂糖、乙二胺四乙酸二钠（NazEDTA）、冰醋酸、氯化钠、澳酚蓝、漠化乙锭、十二烷基硫,酸钠（SDS）、灭菌超纯水,2.3 引物,引物序歹リ:F1 ： 5TAT CGG GAG ATG AAA GAC - 3，； F2 ： 5GTA ATG TCT AAG GAC,TAG-3，；Revx： 5?- CCT CGC GGC TTC GTC - 3\引物在使用时用灭菌超纯水稀释为20产mol/L,靶基因片段序列及引物在靶基因中的位置参见A. 3,2.4 样品采集,2. 4.1气管分泌物,用灭菌棉拭子蘸取气管分泌物,放入无菌试管中,2. 4.2肺脏,无菌采集肺脏病变部位或病变/非病变部位交界处的样品,2.4.3关节液,若有关节囊肿,在囊肿部位表面常规碘酊消毒,用2 mL或5 mL灭菌注射器穿刺,无菌吸取1 mL.,2 mL关节渗出液,2.4.4采集的样品,应在4℃条件下立即送到实验室,2. 5 DNA提取,2. 5. 1样品处理,2.5. 1.1气管分泌物拭子,将每支拭子浸入1 mL.2 mL NET缓冲液中30 min,反复挤压。将浸出液经4℃ 7 500 g离心,15 min后,弃上清。收集沉淀,用1 mLNET缓冲液重悬,2. 5. 1.2肺组织,将肺组织样品剪碎,按1 g加入。. 9 mLNET缓冲液研磨后,用双层灭菌纱布过滤。收集过滤液于,2ni灭菌离心管,4℃ 7 500 g离心15 min,弃上清。收集沉淀,用1 mLNET缓冲液重悬,1,ny/t 2417—2013,2. 5. 1.3关节液,将500 fzL关节液和500 rL NET缓冲液等体积混匀后,7 500 g离心20 min,弃上清,收集沉淀,用ImLNET缓冲液重悬,2. 5.2 DNA的提取方法,2. 5. 2. 1取2.5.1中制备的样品悬液500トレ加入100 rL 20%的SDS（终浓度3. 4%）,混匀。在,95℃~100℃孵育10 min后,迅速放置于冰上冷却10 min.15 min,2. 5. 2. 2在样品中加入RNaseA至终浓度为40kg/mL,50℃水浴30min。然后,加入蛋白酶K至终,浓度为 200 Mg/mL,50 ℃水浴 30 min,2. 5. 2. 3加入等体积的酚ー氯仿ー异戊醇（25 : 24 ： 1）,手颠倒摇匀2次.3次,4℃ 9 000 g离心,10 min,2. 5. 2. 4转移上清液于另一离心管中,2. 5. 2.5重复2. 5. 2. 3、2. 5. 2. 4操作过程,加入2. 5倍体积的预冷无水乙醇,手颠倒摇匀2次.3次,—20℃沉淀 30 min,4℃12 000 g 离心 !0 min,弃去液相,2. 5. 2. 6用1 mL70%乙醇漂洗,4℃12 000 g离心2 min,弃上清,真空或室温下干燥DNA沉淀,2. 5. 2.7 DNA沉淀用25步L.50 jzL无菌超纯水溶解作为模板,保存在ー20℃备用,3 PCR试验,3. 1反应体系,10XPCR buffer（含 Mg2+） 5 匹,脱氧三磷酸核甘酸混合液（dNTPs） 4,Fl引物和F2引物 各0.5匹,Revx 弓 物 1 fzL,模板（被检样品总DNA） 2mL,无菌超纯水 36. 5 mL,Taq DNA聚合酶 0. 5ル,样品检测时,同时要设阳性对照和空白对照,阳性对照模板为靶基因（副猪嗜血杆菌16S rRNA基,因片段）重组质粒,空白对照为灭菌超纯水,3.2 pcr反应程序,94℃变性3 min,然后35个循环,分别为:94℃变性1 min,56℃退火45 s,72℃延伸1 min;最后72℃,延伸10 min,4℃保存,3.3 电泳,3. 3.1 1 %琼脂糖凝胶板的制备,称取1 g琼脂糖置于10。mL TA……
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